回歸傳統 2D 橫向捲軸玩法的《新超級瑪俐歐兄弟 Wii》，首度加入最多四名玩家攜手合作闖關的功能，從此，瑪俐歐不再是單獨一人，可以和路易等人一同冒險，強化多人同樂的樂趣。
《新超級瑪俐歐兄弟 Wii》讓玩家能夠互相競爭與合作，你可以舉起同伴並將他們丟出，藉此保護他們避開危險。此外，廣受歡迎的耀西也再度登場，除了提供角色騎乘的功能外，耀西還能伸出它們的舌頭將敵人、甚至是同伴給吞到肚子裡。
在某些如同蹺蹺板的場景中，第一個跳上的玩家必須以 Wii 的控制器取得平衡後，才有辦法到達更高的平台；相反的，你也可以讓平台開始搖晃，擾亂其他玩家的通行。
《新超級瑪俐歐兄弟 Wii》也加入了更多的新道具，例如螺旋槳頭盔可以讓瑪俐歐的滯空能力大幅強化，甚至一口氣直衝天際；另外，也可以變身為企鵝，以不同於火球的冰塊攻擊將敵人凍結。
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